Библиотека: "Искусственное осеменение собак" -2

автор Njusja Чт Июл 03, 2014 6:40 pm

1. Необходимость разбавления спермы производителей

Главное преимущество метода искусственного осеменения— это возможность максимально использовать высокоценных племенных производителей путем осеменения многих самок спермой одного эякулята. Чтобы увеличить объем эякулята, а также для того, чтобы сохранить оплодотворяющую способность спермиев на более длительный срок при хранении спермы вне организма, надо разбавить сперму специальными биологическими и синтетическими средами. Для сохранения спермы вне организма требуются условия, которые тормозили бы расходование внутренних энергетических запасов в спермиях, сохраняли бы их оплодотворяющую способность и не вызывали гибель.

Среды для разбавления спермы должны иметь определенные физико-химические свойства и такую концентрацию составных веществ (компонентов), при которой осмотическое давление было бы наиболее благоприятным для жизнеспособности спермиев того или иного вида животных. Поэтому следует применять качественные компоненты, точно отвешивать вещества в соответствии с рецептом разбавителя и готовить его на дистиллированной воде, чтобы получить необходимое осмотическое давление среды.

При составлении рецептов разбавителей надо учитывать, что спермин сохраняют жизнеспособность только в определенных пределах кислотности (концентрации во дородных ионов). Избыточная кислотность и чрезмерная щелочность, как указывалось, убивают спермиев. Следовательно, в разбавители спермы могут входить слабые кислоты и щелочи в незначительных количествах. Разбавители не должны содержать солей многовалентных металлов (свинца, олова и др.), а также различных ядовитых и пахучих веществ, губительно действующих на спермиев. Для приготовления сред нужно брать химически чистые компоненты. Кроме того, они должны быть вполне доброкачественными, отвечающими соответствующему ГОСТу.

В разбавители вводят сахара (неэлектролиты): глюкозу или лактозу и др., которые служат спермиям энергетическим материалом для гликолиза (фруктолиза) и процессов дыхания. Сахара можно заменять гликоколом (аминоуксусной кислотой), медом.

Разбавитель должен устранять или ослаблять температурный шок (холодовый удар) спермиев. Для этого в состав разбавителей введен желток куриного яйца, содержащий лецитин и повышающий устойчивость спермиев к резкому охлаждению, а при замораживании — глицерин.

В сперме барана или быка при хранении образуется молочная кислота; желток куриного яйца, вводимый в разбавитель, имеет реакцию более кислую, чем сперма (рН 6,2). Естественная буферная способность спермы не может! полностью нейтрализовать молочную кислоту и кислотность желтка куриного яйца. Поэтому в состав разбавителей спермы быка и барана нужно вводить ли монно-кислый натрий (цитрат), являющийся буфером и имеющий несколько щелочную реакцию (рН 7,8—8,0); он нейтрализует излишнюю кислотность.

В целях понижения содержания в сперме ионов кальция и магния в состав некоторых синтетических сред для разбавления спермы, например хряка, вводят двунатрие вую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (синони мы ЭДТА, хелатон-3, трилон-Б), которая, связывая ионы кальция и магния, тормозит активность ферментов протеаз, аденозинтрифосфотаз и понижает обмен веществ в спермиях, сохраняемых при комнатной температуре. Вследствие этого спермин более продолжительное время сохраняют свою живучесть.

Для.предупреждения развития микроорганизмов в сохраняемой сперме в разбавители добавляют антибиотики и сульфаниламидные препараты (стрептомицин, пенициллин и стрептоцид или спермосан-3) в дозах, указанных в действующих инструкциях по искусственному осеменению (санация спермы).

Среды, применяемые для разбавления спермы, должны быть стерильными.

В. К. Милованов (.1962) предложил различать три класса синтетических сред или разбавителей спермы в за висимости от их состава и назначения:

класс А — экстендоры (от лат. экстендо — увеличи вать, расширять). Это сахаросолевые растворы, применяемые для разбавления спермы с целью увеличения ее объема, но без охлаждения, хранения и транспортиров ки (глюкозо-фосфатные, глюкозные и др.);

класс Б — протекторы (защитные среды). Представляют собой те же экстендоры, но с добавлением к ним желтка куриного яйца, глицерина или других веществ, предохраняющих спермин от холодового удара и кристаллизации при замораживании;

класс В — имплементоры (оснащенные), то же экс тендоры или протекторы, но к ним добавлены специаль ные вещества, воздействующие на органы размножения самок при осеменении, например ферменты (муциназа), нейротропные (прозерин, карбахолин), гормональные (окситоцин, питуитрин) и другие вещества. Муциназа, например, разжижает связь в шейке матки и способствует таким образом продвижению спермиев. Гормональ ные и нейротропные препараты вызывают усиление сокращения матки.

Рецептура синтетических сред для разбавления спер мы весьма разнообразна как в количественном, так и в качественном отношении: она зависит от вида животного и способа хранения разбавленной спермы вне организма.

2. Приготовление разбавителей

Вся посуда для приготовления разбавителя, а также стеклянные палочки, пипетки, термометр для измерения температуры в разбавителе должны быть чистыми и простерилизованными. Мензурки и банки с разбавителем и разбавленной спермой закрывают стерильными крышками или полиэтиленовыми салфетками.

а/Синтетические среды готовят на прокипяченной дистиллированной воде Глюкозу, лактозу и другие вещества используют чистые, без загрязнения, с нормальной влажностью по ГОСТу. Куриные яйца применяют добро качественные и только из хозяйств, благополучных по инфекциям птиц.

Готовят разбавители непосредственно перед получением спермы от производителей с таким расчетом, чтобы от времени приготовления до момента использования прошло не более 3—4 ч. В стерильный сосуд (колбу) с чашки весов, предварительно протертой тампоном, смоченным 90 %-ным спиртом, высыпают точно отвешенные в соответствии с рецептом глюкозу и другие вещества (кроме желтка, глицерина и антибиотиков), входящие в состав разбавителя, вливают необходимое количество дистиллированной воды и размешивают покачиванием колбы до полного растворения. Если нет растворимого стрептоцида, а имеется слаборастворимый, то его первым нужно отвесить и всыпать в колбу, залив небольшим количеством горячей дистиллированной воды. Затем среду стерилизуют в течение 5—10 мин в водяной бане и охлаждают до 35—40 °С.

Куриные яйца, из которых берут желток, обрабатывают следующим образом: тщательно моют щеткой, протирают спиртовым (96 %-ным) тампоном, раскалывают пополам, сливают белок в банку, а желток осторожно перекладывают на стерильный листок фильтровальной бумаги. Держа его в левой руке, перекатывают желток на бумаге, чтобы остатки белка впитались в бумагу. Стерильным скальпелем прокалывают сбоку пленку желтка и сливают его в стерильную мензурку; левой рукой держат за края фильтровальную бумагу с желтком, а палцами правой руки поглаживают фильтр снаружи к месту пролома. На фильтре остается только тонкая пленка.

Желток куриного яйца, антибиотики или спермосан-3 и глицерин добавляют в среду, когда ее температура будет не выше 40 "С,

Для приготовления молочного разбавителя берут свежевыдоенное молоко от коровы или кобылы, процеживают через чистую марлю в стеклянную или эмалированную посуду и подогревают до кипения; снова процеживают через стерильную марлю и охлаждают до 30—35 °С. К. Л. Левин рекомендует подогревать коровье молоко до 94 °С. Затем в молоко добавляют желток куриного яйца, антибиотики и также стрептоцид в тех же количествах, что и в синтетические среды. Если сперму, разбавленную молоком, не собираются хранить (при температуре 2—4°С), то желток можно не добавлять. При нагревании, чтобы молоко не выпаривалось, посуду следует на крыть. Можно также использовать сухое полужирное мо локо (10 г на 100 мл дистиллированной воды; кипятят до растворения сухого молока).

3. Техника разбавления спермы

Сперму нужно разбавлять не позже чем через 5—10 мин после ее получения

на искусственную вагину. При разбавлении необходимо соблюдать меры предосторожности, так как спермин очень чувствительны к изменению условий среды. Разбавитель нагревают до температуры (25—-30 °С), близкой к температуре спермы. Для этого посуду с разбавителем ставят в теплую воду с температурой около 35 °С. Вместе с тем полученную сперму постепенно охлаждают к моменту разбавления до такой же температуры, что и раз бант ель. 15 измеренноеколичество спермы медленно, топкий струйкой по стенкам вливают порциями отмерен ем разбавителя, слегка перемешивая покачиванием емкости. При таком способе состав среды будет измениться постепенно. Чтобы убедиться в том, что разбавление не снизило качество спермы, каплю разбавлен ном спермы просматривают под микроскопом. Если оценка по подвижности спермиев резко снизилась, то разбавленную сперму бракуют, а разбавитель готовят снова.

Биологический контроль качества компонентов разбавителей производится при поступлении на станцию или пункт искусственного осеменения новых партий антибиотиков, сульфаниламидов, глюкозы, лактозы и других веществ, входящих в состав среды. Токсичность или без вредность препаратов определяют по показателю выживаемости в ней спермиев (балл/ч), т. е. по времени хранения (ч), при котором активность (балл) их снизилась, или по показателю абсолютной выживаемости спермиев. Следует иметь в виду, что иногда сразу после разбавления подвижность спермиев несколько снижается, но спустя 10—15-мин восстанавливается.

В помещении, где проводят разбавление, разливку и фасовку спермы в простерилизованные полипропиленовые соломинки, капилляры (пайетты), ампулы, капсулы, пробирки, флаконы или бутылочки, температура должна быть 20—25 °С; приготовление сред, разбавление и фа совку спермы необходимо проводить в стерильной ком нате или в настольном боксе, в который помещают все необходимые материалы и приборы .

Наполненные флаконы сразу же закрывают пробка ми из белой резины и прикрепляют к ним сопроводительные этикетки. Ампулы запаивают и маркируют. Если разбавленную сперму от нескольких производителей направляют в .одно хозяйство, то флаконы, ампулы капилляры и т. д. маркируют в разные цвета.

Степень разбавления. Сперму быков можно разбавлять в 5—50 раз, т. е. к одному объему спермы приливают 4—49 объемов разбавителя. Чаще разбавля ют в 20—50 раз (1 : 19—1 : 49), но в одной дозе должно быть не менее 15 млн спермиев с прямолинейно-поступа тельным движением в 4 балла (40 %).

Сперму барана разбавляют в 2—4 раза (1 : 1 — 1 : 3, 80 млн спермиев), сперму жеребца — в 2—4 раза (Змлрд спермиев) и хряка — в 2—10 раз (не менее 3 млрд спер миев), сперму гусака или индюка— 1 : 1 — 1 : 2, также в зависимости от концентрации прямолинейно-подвижных спермиев в эякуляте.

В начале каждого квартала и сезона наиболее интенсивного использования следует испытывать оптимальную степень разбавления спермы каждого производителя станции (по показателю абсолютной выживаемости ) спермиев, согласно инструкциям по искусственному осе { менению и применяемому способу хранения).

4. Способы хранения спермы

Хранение спермы вне организма, имеющее целью увеличение срока выживаемости спермиев и их оплодотворяющей способности в замороженном или незамороженном состоянии, основано на снижении обменных процессов в сперме, на создании условий, при которых спермин впадают в анабиоз.

Хранение спермы в незамороженном со стоянии. При хранении спермы при температурах от 0 до 20 °С используют синтетические среды, в которых спермин переходят в состояние анабиоза. С этой целью на них воздействуют двуокисью углерода (СО₂), растворенном и плазме спермы. Часть двуокиси углерода при реакции с водой превращается в угольную кислоту (П₂С0з), которая легко проникает через оболочку спермиев и тормозит процессы дыхания и гликолиза (фруктолиза).

Метод насыщения разбавленной спермы СО₂ вследствие неустойчивого эффекта широкого распространения не получил. Позднее были получены удовлетворительные результаты по кислотной инактивации (рН 6,4—6,5) пу тем добавления в разбавители лимонной кислоты, сульфата калия, магния.

Так, для спермы быков были предложены синтетические среды, позволяющие сохранить ее при сравнительно высоких температурах, например разбавитель ТВТ-12, разработанный Таджикским научно-исследовательским институтом сельского хозяйства (температура хранения от 15 до 18°С](/Его состав: вода дистиллированная — 1000 мл, глюкоза медицинская — 3,0 г, натрий лимонно кислый — 26,5, калий хлористый — 0,4, лимонная кисло та — 1,0 г, желток куриного яйца — 100 мл. Оптимальная степень разбавления 1 :20—1 : 32; срок хранения 72 ч.

Удовлетворительные результаты сохранения спермы быка при температуре около 5 °С за счет холодового действия достигаются и разбавлением ее глюкозо-цитратно желточной средой, но хранить ее можно только в течение 36—48 ч после разбавления.

Для спермы хряка при хранении ее при температуре около 16—20 °С в течение 3 сут в настоящее время при меняют среды следующего состава: 1) рецепт ГХЦС (И. Г. Балашов, М. В. Силаева, 1968): вода дистиллиро ванная—1000 мл, глюкоза медицинская безводная — 40г,,ЭДТА (хелатон-3)—2,6, натрий двууглекислый (со да очищенная) — 0,5, натрия лимоннокислый трехзащи щенный пятиводный — 3,8, сульфат аммония очищен ный— 1,8 г, спермосан-3 — 250 тыс. ЕД. Этой глюкозо хелато-цитратно-сульфатной средой' можно разбавлять чу хряка в зависимости от концентрации спермиев — I раза. В случае хранения спермы при температуре 8—10 °С в среду нужно добавить 3—4 г желтка куриного яйца; 2) рецепты новой среды ГХЦСН-РУ1: вода дистиллированная — 100 см³, глюкоза безводная — 3,7 г, натрий цитрат (лимоннокислый) трехзамещенный (5,5-вод ный) —0,05 г, этилендиаминтетрауксусной кислоты три натриевая соль (ЭДТА-3) — 0,5 г и натрий сернокислый безводный — 0,25 г. Компоненты этой среды выпускают ся промышленностью.

Разбавленную сперму при указанных температурах хранят в посуде из темного стекла в затемненном про чном месте (погреб и т. п.).

Сперму барана, разбавленную глюкозо-цитратно-жел точной средой, хранят при температуре 10—18°С не бо лее 6 ч, а сперму жеребца — не более 2 ч, так как в по следующие часы оплодотворяющая способность сперми ев резко снижается.

X/ Для хранения спермы при 0—5 °С ее разбавляют сре дой, приготовленной по одному из следующих рецептов (глюкозо-цитратно-желточные разбавители)

Разбавители готовят непосредственно перед их использованием. В продаже имеются и готовые разбавители. Выпускают их в виде порошка или таблеток. На станциях и пунктах искусственного осеменения сухие разбавители перед употреблением растворяют в прокипяченной дистиллированной воде, кипятят и охлаждают до 30—40 °С, после этого добавляют желток и спермо-сан-3.

При храпении спермы производителей при 0—5°С применяют и молочные разбавители, в том числе для спермы хряка. Так, К. Л. Левин широко использует молочную среду в свиноводческих хозяйствах. Разработано еще много других рецептов для разбавления спермы, например фруктозо(или лактозо) цитратно-желточный разбавитель для спермы баранов (дистиллированной воды 100 мл, фруктозы 0,68 г, лимоннокислого натрия 2,6 г, желтка 20 мл).

Оценку, разбавление вышеуказанными средами, фа совку и охлаждение спермы до 0—5°С не следует затягивать, так как хранение спермы при комнатной темпе ратуре неблагоприятно отражается на спермиях вследствие накопления в сперме продуктов обмена. Однако слишком быстрое охлаждение спермы может привести к холодовому удару. Поэтому после разбавления сперму следует выдерживать при комнатной температуре 20— 30 мин (за это время обычно ее фасуют).

Ампулы или флакончики со спермой спустя 20— 30 мин после разбавления помещают в баночки со льдом, бытовой холодильник или пищевой термос со льдом. Что бы предупредить холодовой удар, флакончики или про бирки со спермой обертывают небольшим слоем ваты и делают между ними и льдом прослойку толщиной 0,5 см, используя для этого синтетические и резиновые мешочки.

При хранении спермы в холодильнике необходимо проверить, чтобы температура в нем была в пределах 0—5°С. Сроки хранения разбавленной спермы при этой температуре ограничены. Сперму быка и хряка хранят не более 3 сут, сперму жеребца — 2 сут, барана — 1— 1,5 сут. Подвижность спермиев при осеменении должна быть не меньше (соответственно) 7, 6, 5 и 8 баллов.

В состав разбавителя спермы кроликов входят: вода -дистиллированная—100 мл, глюкоза безводная — 3,9 г, лимоннокислый натрий трехзамещенный пятиводный — 0,55 г, желток куриного яйца — 5 мл.

Для разбавления спермы гусака используют среду ВНИТИП: дистиллированная вода — 100 мл, натрий глутаминовокислый— 1,67 г, натрий лимоннокислый — 0,57, фруктоза, глюкоза — 0,31. Разбавленную сперму используют в течение 30 мин.

Для разбавления спермы индюка применяют раствор Лейка: дистиллированная вода — 100 мл, лимоннокислый калий —0,123 г, натрий уксуснокислый — 0,513, магний хлористый — 0,0676, глюконат натрия— 1,92 и глюкоза, фруктоза— 1,0 г. Разбавляют сперму— 1 : 1 — 1 :2 и используют без хранения.

Хранение спермы в замороженном состоянии. Во время хранения обменные процессы в сперме при кислотном анабиозе, а также при темпера туре 0—5 °С хотя и значительно снижены, но все же протекают на довольно заметном уровне. Спермин стареют, расходуют питательные вещества, отравляются продуктами обмена, разрушаются и гибнут. В результате оплодотворяющая способность их при хранении спермы ограничена несколькими сутками. Более глубокий анабиоз с почти полным прекращением обменных процессов достигается замораживанием спермы при низких темпера турах (минус 79—196 °С).

автор Njusja Чт Июл 03, 2014 6:40 pm

5. Замораживание спермы быков

В настоящее время способ медленного замораживания спермы быков уступил более производительному быстрому замораживанию, при котором глубокое охлаждение спермы до температуры жидкого азота (минус 196 °) достигается в течение не скольких минут. В результате удается лучше сохранить структуру спермиев, получить относительно высокую активность спермы после оттаивания.

Для замораживания спермы быков в полипропиленовых соломинках или в форме гранул, в том числе облицованных, рекомендованы специальные разбавители, приборы и технологические приемы, которые в основ ном сводятся к следующему.

Замораживание спермы быков в полипропиленовых соломинках. Для этого используют лактозо-фруктозо-раффинозо-магниево-глицерино желточную среду (ЛФРМГЖ) следующего состава: лак тоза— 80,5 г, фруктоза — 12,0, раффиноза пятиводная — 19,5, магний сернокислый — 0,1 г, глицерин — 50,0 мл, спермосан-3 — 500—700 тыс. ЕД, желток куриных яиц — 200 мл, вода дистиллированная — 1000 мл.

Сухие заготовки среды вносят в стерильную колбу, добавляют необходимый объем прокипяченной дистилли рованной воды 70—80 °С, растворяют, охлаждают до 30—32 °С и добавляют спермосан, глицерин и желток. При отсутствии сухих заготовок компоненты среды стерилизуют ультрафиолетовыми лучами в бактерицидной камере в течение 15—20 мин, отвешивают нужное количе ство и готовят среду, простерилизовав ее в водяной бане 5—10 мин, после охлаждения добавляют спермосан, гли церин и желток. Разбавляют сперму при температуре 30—32 °С и переносят стеклянный стакан с нею в водяную

баню с температурой воды 22 °С на 20 мин. Дальнейшая обработка спермы проводится при комнатной темпера туре.

Разбавленную сперму до нужной концентрации спермиев в дозе (не менее 15 млн) фасуют в стерильные по липропиленовые соломинки емкостью 0,25 мл. Для автоматического наполнения соломинок используют сиеци альные приборы, при помощи которых в соломинки нагнетается сперма и производится закупорка. Соломинки закупоривают с обоих концов шариками: один шарик служит в качестве поршня, другой — герметизирующей пробкой. При заполнении соломинок в вакуумной камере используют соломинки с пробкой-поршнем, погружая их в стакан <;о спермой. После откачивания воздуха и создания небольшого вакуума (0,92 атм) включают насос, поднимают поддон со спермой, чтобы открытые концы соломинок погрузились в сперму на 4—5 мм. Медленно впускают воздух и поднимают поддон по мере уменьшения объема спермы в стакане.

После наполнения соломинок между пробками и спер мой остается воздушный пузырек длиной 8—10 мм, который перемещают в середину соломинок путем энергичного встряхивания, предупреждая этим возможность по падания в соломинку жидкого азота. Заполненные спермой соломинки ставят в специальные штативы при помощи счетных реек, имеющих 125 пазов, а затем помещают в пластмассовые коробки, этикетируют их и для постепенного охлаждения спермы (в температурном ин тервале 22—40 °С со скоростью 0,3—0,5 °С в минуту) ставят в холодильник при 4 °С на 3—4 ч. Перед замораживанием определяют подвижность спермиев: если она ни же 8 баллов, сперму не замораживают.

Замораживают сперму в соломинках в специальном хранилище КВ 6202 в газообразном азоте на медном щите толщиной 1,5—2 мм при температуре минус 120— 130 °С. Цикл замораживания продолжается 5 мин. Одновременно можно замораживать до 750 спермодоз. Изменения температуры спермы и испаряющегося азота контролируют потенциометром КСП-4 с подключенными термопарами.

После замораживания соломинки помещают специальным собирателем с деревянной ручкой в пластмасс вые стаканы высотой 97 мм, диаметром 65 мм, вмещающие 500 голомшкж, для дальнейшего хранения в стационарном хранилище спермы быков-производителей.

Замораживание спермы быков в облицованных гранулах. Для разбавления спермы используют две синтетические среды следующего состава: среда № 1 — 11 %-ный раствор лактозы или сахарозы —

103 мл, желток куриных яиц — 30 мл, глицерин — 7 мл; среда № 2 — лактоза или сахароза — 6 г, натрий лимонокислый трехзамещенный пятиводный — 1,4 г, глице рин — 5 мл, вода дистиллированная — 100 мл.

Непосредственно после взятия сперму разбавляют средой № 1 в соотношении 1 : 1 и выдерживают при комнатной температуре (18—22 °С) в течение 5—10 мин (до окончания оценки эякулята). Затем дополнительно ее разбавляют средой № 2 той же температуры до требуемой в дозе концентрации спермнев (не менее 15—20 млн). Для этого используют два специальных устройства, позволяющих дозированно вводить среды в спермоприемник по закрытой системе без соприкосновения с окружающей средой. Устройство со средой № 1 помещают в термостат мри температуре' 35 °С , устройство со средой № 2 используют в комнатных условиях .

Для фасовки спермы используют тонкостенную поли мерную трубку диаметром 3,8—4 мм, с толщиной стенки 120 мкм. Предварительно ее стерилизуют ульфтрафиолеТОВЫМИ лучами (лампа ПРК.-2) в течение 25 мин. Поступает трубка в готовых бобинах, которые вкладывают в автомат ПРЖ , подача которой контролиру ется направляющей рейкой. Заполненную спермой трубку подводят к сварочному узлу автомата, который раз деляет ее на спермодозы объемом 0,25—0,33 мл с одно временной герметизацией каждой дозы, одновременно происходит маркировка на специальной приставке. Спер модозы собирают в приемный бункер, откуда их перено сят в маркированные алюминиевые тубы диаметром 40 мм, которые закрывают поролоновыми пробками. Пос ле этого заполненные тубы ввинчивают в обоймы устрой ства для эквилибрации и замораживания (ЭКЗ) и поме щают в холодильник (2—5 °С) для выдерживания в те чение 4—6 ч при постоянном вращениий обойм со скоростью 2—10 об/мин.

По истечении выдержки заполненные тубами обоймы снимают с аппарата, крепят к ним стержни-держатели и переносят в сосуд, заполненный жидким азотом («Харьков-30» или другие широкогорлыеемкости). Обойму с тубами погружают в жидкий азот на максимальную глубину, но так, чтобы он не попал внутрь туб через верхний край. Замораживание спермы продолжается 8— 10 мин, после чего обойму с тубами полностью погружают в жидкий азот и оставляют до проверки качества спермы. Тубы с качественной спермой закрывают поролоновыми пробками, отсоединяют от обоймы и тут же переносят в емкости для хранения в жидком азоте.

Замораживание спермы в гранулах нафторопластовых пластинках. Сперму быка предварительно разбавляют до нужной концентрации спермиев лак-тозо-желточной средой с глицери ном: лактоза—11,5 г, желток — 20 мл, глицерин — 5 мл, спермосан— 50 тыс. ЕД, вода дистиллирован ная— 100 мл. Затем ее охлаждают при 2—5 °С в течение 3—4 ч в холо дильнике. После эквилибрации проверяют ее на подвижность спермиев, допуская к замораживанию сперму не ниже 8-балльной оценки, а затем фасуют по 0,2 (объем лунки) или 0,5 мл на охлажденную пластину из фторопласта. Для этого пластину опускают в жидкий азот и охлаждают в течение нескольких минут до прекращения кипения азота. Охлажденную пластину держателем поднимают к верхнему краю сосуда, после испарения с нее жидкого азота поверхность ее протирают сухим стерильным ватным тампоном, затем посредством градуированных пипеток, шприца или разливочной маши ны разливают сперму в лунки. Пластина в это время име ет температуру минус 160—179 °С. Через несколько се кунд, после того как в последней лунке сперма затверде вает в виде гранулы, пластину опускают ближе к жид кому азоту и сперму замораживают на расстоянии 5— 10 см от его поверхности в течение 1—2 мин. После этого пластину с гранулами спермы погружают на 1 мин в жидкий азот, где они охлаждаются до минус 196 °С. За тем пластину вынимают, сгребают гранулы в охлажден ный контейнер и переносят в сосуды Дьюара с жидким азотом на хранение или для транспортировки.

Для замораживания спермы быков в необлицованных гранулах нужно иметь следующее оборудование: емкость для азота 30X40X30 см или широкогорлый сосуд Дьюара, фторопластовые пластинки 20X20x2 см, 25х12,5х Х1,2 или 25X25X2 см с лунками на 0,2 мл для концен трированных гранул, требующих дополнительного раз бавления, или на 0,5 мл для гранул, не требующих до полнительного разбавления на пунктах искусственного осеменения; держатель пластины, контейнеры для сбора гранул, лопатки для съема гранул с пластины, колбы химические, пластмассовые или стеклянные, контейнеры 100—200 мл для хранения гранул в сосудах с жидким азотом, воронки для ссыпания гранул в колбы или контейнеры, корнцанги и пинцеты, кольцевидный пинцет для фиксации и переноса колб или контейнеров, фильтры из белой гигроскопической ваты для очистки жидкого азо та, пластмассовые баллончики-капельницы, или шприцы 25—30 мл, или делительные воронки, или пипетки для фасовки спермы в лунки пластин. После замораживания оттаивают несколько ампул, соломинок, капилляров или гранул и проверяют, активность спермы. Для дальнейшего хранения в замороженном состоянии допускают сперму, имеющую активность спермиев не ниже 4 баллов.

Сперму разных быков с учетом их породности хранят в стационарном хранилище в отведенных для них секциях.

6. Замораживание спермы жеребцов, хряка и барана

Применяют ту же методику быстрого охлаждения с одномоментным разбавлением спермы лактозо-хелато-цитратной средой: во да дистиллированная — 100 мл, лактоза—11 г, натрий

двууглекислый — 8 мг, натрий лимоннокислый — 89, хелатон-3 — 100 мг, желток куриного яйца — 1,6 мл, глицерин — 3,5 мл, спермосан — 25 тыс. ЕД. Разбавленную сперму — 1 : 3—1 : 4 разливают по 25 мл в охлажденные алюминиевые пакеты, крепко закрывают, дважды закатывая, и замораживают в парах над жидким азотом (1—2 см от поверхности на пенопластовом поплавке) в течение 5—7 мин, после чего пакеты переносят в жид кий азот. При замораживании спермы в виде гранул ее наносят каплями по 0,2 мл в лунки на поверхность сухого льда. Через 5 мин после замораживания гранулы собирают, упаковывают в алюминиевые тубы или пласт массовые стаканы (125—150 гранул=25 мл в дозе для осеменения) и помещают на хранение в сосуд с жидким азотом.

Замораживание спермы хряка и барана. В последнее время разработаны разбавители и техника замораживания спермы хряка и барана, аналогич ные вышеизложенным. Но результаты применения такой спермы широкого практического значения пока не имеют из-за невысокого процента оплодотворяемости.

7. Транспортировка спермы

Для перевозки спермы в хозяйства используют различной конструкции емкости сосуды Дыоара СДС-5 и др., термосы для ее сохранения и разные виды транспорта. Обычно со станции искусственного осеменения сперма производителей доставляется в хозяйства на пункты автотранспортом. Сперма высокоценных производителей нередко транспортируется в различные зоны страны авиа- и железнодорожным транспортом.

Основные требования к транспортировке спермы в термосах и емкостях — предохранить их от тряски (прокладки из поролона или других материалов), не до пускать повреждения и нарушения температурного режима. Доставка спермы должна производиться в возможно короткие сроки. Вместе со спермой в хозяйство направляют ордер-накладную (2 экз., один возвращают на станцию), в которой указывают качество спермы. При транспортировке по железной дороге или самолетом термосы, упаковки со спермой пломбируют и снабжают этикетка ми с указанием места назначения и адреса отправителя. Для перевозки спермы производителей в хозяйства и хранения ее на колхозных и совхозных пунктах при температуре 0—4 и 5—20 °С пользуются термосами раз ной конструкции (термосы-ящики, бытовые сумки-холодильники). Чаще применяют пищевые термосы — это двустенные стеклянные колбы с безвоздушным пространством между стенками, помещенные в пластмассовый или жестяной футляр. Колбу закрывают корковой пробкой у. крышкой. Эти термосы хорошо сохраняют-температуру, но они очень хрупки. Их удобнее использовать для стационарного сохранения спермы на пунктах, а для перевозки спермы лучше использовать более прочные термосы.

Сперму быков и баранов-производителей при температуре хранения 0—5 °С перевозят в широкогорлых пи щевых или пластмассовых термосах.

Полиэтиленовый термос (конструкции ВИЖ и др.) — двустенный сосуд из полиэтилена с порошково-вакуум ной термоизоляцией; емкость его 3,7 л. Температура 2— 4°С поддерживается в чем в течение 72 ч. Пробирки, ам пулы, флаконы со спермой укладывают в вату или специальные поролоновые амортизаторы, которые с орде ром помещают в прозрачные полиэтиленовые мешочки, и запаивают их, затем укладывают на лед термоса и сверху кладут небольшое количество льда или снега, имеющего температуру 0°С (лед или снег, взятый со двора во время сильных морозов, необходимо подержать в помещении до начала таяния и проверить температуру термометром). При температуре ниже 0°С спермин погибают.

При транспортировке спермы зимой следует учитывать, чтобы окружающая температура воздуха была не ниже минус 5 °С, если она ниже, то принимают меры для утепления термоса.

В южных зонах страны для перевозки спермы быков и баранов, разбавленной специальными средами при температуре 10—18 °С, используют те же термосы, но за полняют их прохладной водой, а для поддержания указанной температуры добавляют кусочки льда.

Разбавленную сперму хряков транспортируют в термосах различных типов («Харьков ТС-3», поролоновый термос, термос-ящик «Полтавский» или бытовые сумки холодильники и др.). При транспортировке спермы хря ка в условиях температуры 10—20 °С колбы (бутылочки, флаконы) со спермой плотно закрывают пергаментной бумагой или целлофаном (закрепляют на горлышке кол бы резиновым кольцом) и помещают в термос. После доставки ее на место необходимо снять с колбы резиновое кольцо и хранить сперму негерметически закрытой.

Сперму жеребцов после разбавления транспортируют при температуре 0—5 °С в баночках (50—100 мл) или флаконах из-под антибиотиков с притертыми пробками, фиксируют их резиновым кольцом и погружают в термос со льдом (конструкции ВНИИК. и др.). Чтобы сперма охлаждалась постепенно, сосуды с ней перед этим помещают в полиэтиленовые или марлевые мешочки, предва рительно обернув их тонким слоем ваты. Сверху покрывают тонким слоем льда и закрывают термос крыш кой.

При перевозке спермы следует принимать меры, предупреждающие ее взбалтывание и встряхивание в пути (прокладка ветошью, поролоном и др.). Термосы и сосуды, в которых перевозят сперму, нужно помещать в переднюю часть автомашины, где они будут подвергаться меньшему встряхиванию. Особенно важно соблюдать все эти правила при транспортировке спермы по плохим до рогам.

Главное условие при транспортировке замороженной спермы — постоянное поддержание низкой температуры.

Для перевозки спермы в жидком азоте (минус 196 °С) применяют специальные стальные двустенные сосуды с вакуумно-порошковой либо вакуумной многослойной изоляцией. Сосуды бывают емкостью от 4 до 50 л (АТ-4, АТ-6, СДС-20м, СДС-50, <ОСарьков-34А» и др.). Суточный расход жидкого азота в них колеблется от 5 до 10 %, в зависимости от размеров сосуда. Правила обращения с ними такие же, как и с жидкоазотными хранилищами большого объема.

На пункте хозяйства при получении сосуда с замороженной спермой прежде всего должно быть выяснено, имеется ли в сосуде достаточное количество хладагента, т. е. покрыты ли ампулы им сверху. Если жидкий азот улетучился, то сперма может быть использована только после установления под микроскопом хорошей активности спермиев. Хранить сперму без хладагента нельзя, оттаянную ее можно использовать только в ближайшие часы.

Если в хозяйстве на пункте искусственного осеменения имеется сосуд с жидким азотом, где хранится замороженная сперма, то кассеты или канистры с гранулами, паке ты со спермой в капиллярах-соломинках быстро переносят из одного сосуда в другой, соблюдая технику безопасности.

Санитарно-гигиенические условия при перевозке спермы включают меры профилактики заразных болезней. Инструменты, термосы и посуду, отправляемые станцией для использования на пункте, после обеззараживания возвращают на станцию, где их вновь стерилизуют. Особенно за этим надо следить при обслуживании неблагополучных по инфекционным болезням хозяйств (вибриоз, трихомоноз и др.); в данном случае обеззараживание проводят в обособленном помещении; мягкий упаковочный материал (бумагу, стружку и пр.) немедленно сжигают. Контролирует выполнение этих работ ветеринарный персонал.

Библиотека: "Искусственное осеменение собак" -2

Библиотека: "Искусственное осеменение собак" -2

Re: Библиотека: "Искусственное осеменение собак" -2